崔世军

首都医科大学宣武医院,血管外科

血管新生治疗糖尿病足难点问题及解决方案

一、基本病例


  (一)一般资料:女性,78岁,左足静息痛伴发凉、麻木6个月。既往糖尿病20年,冠心病15年、高血压20年、腔隙性脑梗死10年,查体:左足趾发绀,足背、胫后动脉搏动未触及,左足皮温低。

 

图1左足趾发绀


  (二)专科检查结果:ABI(左)0.1,下肢动脉DSA提示,左胫前、胫后、腓动脉闭塞。见图2A

 

图2A下肢动脉DSA提示,左胫前、胫后、腓动脉闭塞。B自体干细胞移植术后侧枝大量增加


  (三)前期治疗过程:2个月前曾行小腿球囊成形术,但远端无流出道,未成功。


  (四)难点问题:患者下肢缺血严重, Rutherford分期为4期,有严重的静息痛,影响休息和睡眠。患者高龄、合并糖尿病、冠心病、高血压、脑血管病,合并症多且严重,手术耐受性差。下肢动脉血管闭塞严重,介入治疗失败,没有好的流出道, 无法行搭桥手术。


  (五)问题解决方案:血管新生疗法,选择自体骨髓干细胞移植术。患者经过治疗以后静息痛消失,术后6个月DSA检查提示左小腿侧枝血管大量增加。见图2B。


常规操作步骤


  1、术前检查


  包括常规术前检查项目,及各观察指标的准确测定和记录


  (1)患肢发绀及溃疡面积及深度(mm),坏疽范围测量并标记。
  (2)静息痛分级。
  (3)肢体冷感分级。
  (4)测定静息状态下踝肱指数(ABl)。
  (5)经皮氧分压测定TcP02(mmHg)。
  (6)动脉造影(DSA):观察侧支血管形成情况并评分。
  (7)间歇跛行者测定无痛步行时间(分)或跛行距离(m)。
  (8)签署自体干细胞移植知情同意书;手术签字。
  (9)手术前安排干细胞提取及分离设备和人员。
  (10)手术前一天备皮(双侧腹股沟和双小腿操作区)并涂擦安尔碘,然后用无菌巾包裹,若有溃疡及坏疽区域勿弄湿。
  (11)手术前一天根据患者Hb情况酌情备异体血(压积红细胞)200ml备用。
  (12)有坏疽感染者做抗生素皮试。
  (13)术前骨髓穿刺做细胞学检查除外血液病。


  2、术中注意事项


   (1)自体骨髓血的抽取技术


   1)需要的设备和试剂  骨髓活检穿刺针,肝素,生理盐水,无菌瓶(储存骨髓血),载玻片,10ml注射器,利多卡因,床旁心电血压监护设备。


  2)手术步骤  患者取俯卧位,接好床旁心电血压监护设备。常规碘酒、酒精消毒术野,铺无菌巾单,用1%的利多卡因在双侧的髂后上棘部位作局部麻醉,注意必须将麻醉药注射到髂骨的骨膜层,否则穿刺及抽取骨髓时患者会有明显的酸痛,然后用骨穿针进行多点穿刺,穿刺的深度因患者的胖瘦而异,但总的来说合适深度应为骨穿针为髂骨所固定,针尾无法水平推动。


  抽取骨髓时,先抽取1m1做骨髓涂片以除外血液病,然后用已抽取1m1肝素盐水的10ml注射器,抽取9m1的骨髓血,抽取时要有一定的负压,以使处在蜂窝状骨间隙中的骨髓细胞更多地被抽取出来。但速度也不要太快,可以每抽取50ml左右就停一会儿,同时加快输液速度,必要时给予血浆代用品或输血。推荐使用多侧孔骨髓穿刺针,多点多方向抽取,这样可以抽取更多的骨髓细胞。将抽出的骨髓血缓慢贴壁注入无菌瓶中,使之不产生泡沫,同时不断晃动以使肝素混匀避免凝血。在操作台上可以摆放2个无菌盆,一个装有100ml盐水其中加入了3000~5000U的肝素,用于抽取骨髓血的抗凝;另一个装有低浓度肝素盐水,主要用于冲洗抽取骨髓后的注射器和骨髓穿刺针。


  抽取一定量的骨髓后,拔出骨髓穿刺针,压迫3~5分钟,包扎穿刺点,将患者送回病房等待下一步的操作。将盛有骨髓血的无菌瓶盖好,由专人送到干细胞分离室进行下一步的操作。


  (2)骨髓干细胞和自体外周血干细胞的分离和提取


  干细胞的实验室制备要求严格遵守和执行无菌操作原则,分离和制备操作过程做到规范化。


  1)供体样本及干细胞的保存和运输


  ①将装有骨髓的采集瓶/袋封装好,放人专用运输箱(4~8℃)中,由专人采用便捷的运输方式送到细胞分离室;②收到骨髓时,首先要检查采集瓶或袋是否有渗漏和异常。履行交接程序。程序中包括干细胞的获取方式和途径,患者相关的临床资料等生物学信息的交接登记;③细胞制备完毕后,封装好装有细胞的收集瓶/袋,放专用运输箱(4-8℃)中,由专人以便捷的运输方式送到移植室。履行交接程序。程序中要标注明确的细胞制备结果信息并有登记备案;


  2)干细胞分离制备方法:密度梯度离心法。


  按照骨髓干细胞自身的细胞密度与分离介质密度之差,选择合适密度的细胞分离液,以密度梯度离心法进行分离提取;能有效分离开RBC、WBC和单个核细胞,可获得较纯的细胞,密度梯度离心法是目前使用最多的分离制备方法。


  要严格依照上面所述的分离和制备操作的无菌原则逐条要求进行操作。收到骨髓时,首先检查采集瓶或袋是否有渗漏和异常。履行交接程序。具体操作步骤可因所选试剂盒的不同而有差异。


  3)干细胞检测程序


  ①细胞总数检测  细胞计数板计数法/血细胞计数仪计数法;②细胞存活率检测  细胞以0.4%胎酚蓝液染色,计数细胞中活细胞所占比例,细胞存活率=未被蓝染细胞数/总细胞数×100%;③细胞回收率检测 回收率=分离后有核细胞总数/分离前有核细胞总数×100%;④干细胞定性测定  流式细胞仪检测法测定干细胞表面抗原。

 

  (2)干细胞的移植方法

 

  目前我们采用了两种方法进行干细胞移植:缺血肌肉局部注射移植(此例患者采用此种移植法)和介入下缺血下肢动脉腔内移植。术者可根据患者的实际情况选用不同的移植方法。


  下肢缺血肌肉局部注射移植法  患者一般采用腰麻或硬膜外麻醉,麻醉成功后,患者仰卧,常规消毒、铺巾后,在患肢的局部缺血部位进行多点注射。一般相邻两点间的距离为2~3cm,从上向下顺序注射,每个点注射约0.8~1ml,注射深度在1.5~2cm之间。由于患肢多有严重缺血,需要严格无菌操作,以免感染导致肢体坏死,故注射完毕后,用酒精消毒注射部位,用无菌敷料包扎。送患者回病房,整个手术完成。


  3、术后处理


  鼓励患者术后早期下地或床上活动。


  观察患者治疗后1、2、3、6、12个月下肢缺血的改善情况。

 

二、病例二:外周血干细胞移植


  (一)一般资料:男性,63岁,左足第一趾破溃三个月伴静息痛3个月。既往糖尿病15年,冠心病12年、高血压15年,查体:左足第一趾趾尖破溃伴有渗出,足背、胫后动脉搏动未触及,左足皮温低。见图3A。

 

图3A术前左足第一趾溃疡;B移植术后一个月,足趾溃疡愈合。


  (二)专科检查结果:ABI(左)0.15,下肢动脉DSA提示,左胫前、胫后、腓动脉闭塞。见图4A

 

图4  A下肢动脉DSA提示,左胫前、胫后、腓动脉闭塞。B自体外周血干细胞移植术后侧枝大量增加。


  (三)前期治疗过程:应用前列地尔等扩血管药物治疗,效果不佳,足部溃疡经过3个月换药仍旧不能愈合。

  (四)难点问题:患者下肢缺血严重, Rutherford分期为5期,有足趾溃疡伴有静息痛。患者高龄、合并糖尿病、冠心病、高血压,合并症多且严重,手术耐受性差。下肢动脉血管闭塞严重,介入治疗失败,没有好的流出道, 无法行搭桥手术。


  (五)问题解决方案:血管新生疗法,选择自体外周血干细胞移植术。移植术后一个月,足趾溃疡愈合。见图3B。DSA显示自体外周血干细胞移植术后侧枝大量增加。见图4B。


  1997年,Asahara于外周血中发现CD34+细胞,能在体外增殖分化为内皮细胞,将其命名为内皮祖细胞(epithelial progenitor cell,EPC)。血管EPC是干细胞分化过程中的一个阶段,可直接分化为血管内皮细胞。1998年,Shi等证实了EPC来源于骨髓。骨髓中含有大量造血干细胞和EPC,均由造血血管母细胞分化而来。骨髓中还含有其他多种细胞成分和细胞因子。在骨髓的单个核细胞中EPC的含量为3%,是外周血的15倍。骨髓中的EPC可释放入血,但正常外周血中的EPC只有2~3个/ml,故只有通过骨髓动员,使其中的EPC大量进人外周血,才能采集到较大数量的外周血干细胞。


  2002年,Eriko等在国际上首次报道应用自体骨髓干细胞移植治疗下肢缺血性疾病。2003年,黄平平、韩忠朝等在外周血干细胞移植治疗白血病的基础上,利用患者自体外周血干细胞移植治疗下肢动脉硬化闭塞症,取得了有效的结果。谷涌泉等通过自体骨髓干细胞移植和自体外周血干细胞移植治疗下肢动脉硬化闭塞症/糖尿病足的对照研究,发现两种来源的自体干细胞移植具有相似的疗效(P>0.05)。以粒细胞集落刺激因子(GCSF)行骨髓动员5~7天,于循环血中可收集到109~1010个单个核细胞,较骨髓干细胞采集(108个单个核细胞)具有数量优势。外周血干细胞采集通过干细胞分离机完成,对血流动力学指标影响较小,对合并心脑血管疾患的患者提高了安全性。


  改良的外周血干细胞移植技术:传统的方法是骨髓动员需要5~7天,这样做最大的缺点是骨髓动员导致外周血单个核细胞数量增加,动脉血栓形成的风险提高。我们在临床上也发现如果骨髓动员5天以后,外周血中单个核细胞就会有一个降低过程,我们认为这是因为干细胞的归巢到骨髓中。一般4~5天外周血白细胞达到高峰,此时非常容易出现血栓形成;而且传统的做法是由于单个核细胞的量大,需要冻存一半,半年后再解冻为患者加强治疗。因此我们提出改良的外周血干细胞移植动员的新方法。即动员只需要3天即可,这样做的优点是外周血液循环中单个核细胞的量不大,加上常规给予肝素抗凝,就不容易出现血栓,而且一次全部移植采集的单个核细胞,不需要冻存,因为解冻过程中仍然会有部分干细胞丢失。我们在临床实践中采取这种方法以后就很少出现心肌梗死或脑梗死等并发症。


  关于自体外周血干细胞移植前应注意以下问题:


  1、选择合适病变


  (1)适应证

  糖尿病性/非糖尿病性下肢动脉硬化闭塞症。


  (2)临床表现
  具备下面症状与体征之一者:


  1)下肢间歇性跛行(推荐跛行距离<200m的患者)。
  2)下肢静息痛。
  3)足溃疡。
  4)足坏疽。


  (3)影像学表现
  1)小腿动脉闭塞。
  2)股浅动脉闭塞(股深动脉无重度狭窄)。


  (4)其他治疗


  1)保守治疗无效。
  2)手术/介入治疗失败或禁忌。


  2、术前检查


  1)常规化验  血、尿、便常规,生化、凝血、传染病相关化验及肿瘤标记物检测等。
  2)检查  X线胸片、心电图、超声心动图;脑、颈动脉超声等,必要时肺功能检查。
  3)下肢动脉CTA或DSA。
  4)糖尿病眼底情况。
  5)骨髓动员过程中  每日查血常规,监测WBC变化。
  6)干细胞采集后  即刻行血常规、生化及凝血检查。


  3、术前准备


  1)合并症处理。
  2)患者病情评价,能否耐受干细胞采集及移植过程。
  3)向患者及家属详细说明治疗的利弊,签署治疗同意书。
  4)骨髓动员。
  5)干细胞采集准备。


  4、骨髓动员及干细胞采集


  1)用G-CSF或GM-CSF 150~300μg/d,皮下注射,一般持续4~7天,达到目标白细胞总数即可停止动员。
  2)每日监测血象。
  3)当3×109/L<白细胞总数<5×109/L时,应用血细胞分离机分离采集外周血干细胞。对采集到的单个核细胞(或CD34+细胞)进行计数,有条件时进行干细胞活性测定(应≥70%,Trypan blue法)。一般采集一次即可达到所需细胞量。干细胞采集完毕后即刻进行移植。如干细胞需推迟应用,应予4℃冰箱保存,时间不宜超过12小时。

  4)心脑血管疾病患者,骨髓动员过程中给予每12小时皮下注射低分子肝素0.4~0.6ml的治疗。
  5)干细胞分离完毕常规做细菌培养,除外细菌污染。
  6)骨髓动员及干细胞采集过程中可能出现的并发症


  ①骨髓动员可出现发热、骨痛、全身疼痛,偶有皮疹、转氨酶升高等。一般不严重,必要时可以对症处理;②外周血循环细胞增多可能诱发急性心脑血管事件。除注意预防性抗凝外,外周血WBC数量不宜追求过高;③干细胞采集可能出现过敏、电解质紊乱、凝血功能障碍、低钙血症、心律失常、循环不稳定、心脑血管并发症等。干细胞采集过程宜在心电监护下进行,密切观察患者临床表现,采集完毕立即行相应化验检查,以便及时发现和处理问题。


  7)外周血干细胞移植麻醉方法  可根据情况采用局麻(腔内移植法)、硬膜外/腰麻/安定镇痛/神经阻滞(肌注移植法)。


  8)自体外周血干细胞移植方法及术后处理、疗效评价同自体骨髓干细胞移植,请参阅下述内容。


  9)动员采集过程中及采集后监测项目

 

  ①患者原发病情;②密切观察(每日)血象变化,(建议WBC<5×109/L);③建议采集后立即检测电解质、凝血象、血常规;④根据治疗目的不同所需检测的项目;


  特别注意:上述常规为自体外周血造血细胞动员及采集过程中基本的内容,特殊患者需要根据病情制订进一步治疗方案。在外周血造血细胞动员及采集过程中最容易出现的并发症是心脑血管疾病及电解质和凝血象紊乱,经治医师需特别予以注意。

 

三、病例三:脐带血干细胞移植


  (一)一般资料:73岁男性,1个月前外院试行右膝下动脉球囊扩张未成功。右足发凉伴静息痛,既往糖尿病17年,高血压15年,查体:右足足背、胫后动脉搏动未触及,右足皮温低。


  (二)专科检查结果:术前患肢ABI0.39,下肢动脉DSA提示,右胫前、胫后、腓动脉闭塞。见图5A

 

图5,A为术前造影,右胫前、胫后、腓动脉闭塞。B为脐带血干细胞治疗术后3个月造影复查所见,为同一角度位置的不同显影时相。红色箭头所指区域可见明显血管新生和再通。


  (三)前期治疗过程:应用前列地尔等扩血管药物治疗,效果不佳,足部静息痛经过1个月药物治疗仍旧不能缓解。


  (四)难点问题:患者下肢缺血严重, Rutherford分期为4期,有足部静息痛。患者高龄、合并糖尿病、高血压合并症多且严重,手术耐受性差。下肢动脉血管闭塞严重,介入治疗失败,没有好的流出道, 无法行搭桥手术。


  (五)问题解决方案:血管新生疗法,选择异体脐带血干细胞移植术。移植术后一个月,患者的静息痛程度均明显减轻,疼痛评分下降。异体脐带血干细胞移植术后复查动脉造影可见新生侧枝血管。见图5B。术后3个月ABI0.45。


  临床实施一般步骤


  1、脐血干细胞来源及分离、鉴定


  脐血干细胞的制备方法主要包括直接分离法和细胞培养法,其中直接分离法包括流式细胞分析技术及Ficoll密度梯度离心法:①直接分离法:利用流式细胞检测仪根据脐血干细胞表面CD34、CD133抗原分离出未分化干细胞,其中CD31和血管内皮生长因子受体2(VEGFR2)为内皮祖细胞典型标志,故多筛选CD133、CD31抗原阳性及VEGFR2阳性的细胞为内皮祖细胞群。此种分离方法分离出的内皮祖细胞纯度较高,但数目非常小,且细胞活性影响较大,花费较高,操作程序复杂且容易污染。Ficoll密度梯度离心法是根据血细胞及血浆等成分的密度不同,利用淋巴细胞分离液于无菌操作台中经高速低温离心技术进行分离、洗涤,将得到的脐血单个核细胞利用光学显微镜及细胞计数板获取符合要求浓度的单个核细胞悬液,分装置于-80 ℃冻存备用。该方法特点是细胞纯度不高,较经济、操作简便易行。②细胞培养法:上述直接分离法中经Ficoll密度梯度离心法分离得到单个核细胞,其主要细胞成分包括造血干细胞、内皮祖细胞及间充质干细胞,进一步经过贴壁筛选获得纯度相对较高的内皮前体细胞,经纯化的内皮祖细胞可于体外进行诱导分化为成熟的内皮细胞。未经纯化的内皮前体细胞在增殖及迁移能力方面显著高于诱导分化后的细胞,且可经大量扩增后制备细胞悬液待用。由该方案得到的内皮祖细胞浓度较高,细胞活性可靠,操作方法简单且相对经济,在临床及实验研究中获得广泛采用。


  2、脐血干细胞治疗下肢缺血性疾病的移植途径


  移植途径包括局部肌肉注射法及血管腔内注射法。①局部肌肉注射法:将制备好的干细胞悬液0.5 mL,沿患肢股动脉及其分支走向,注入缺血肢体肌肉内,间距1.0cm。②血管腔内注射法:介入下将导管预置于病变节段近端,将制备好的干细胞悬液经导管注射入远端动脉腔内,目前该疗法临床应用较少。


  3、脐带血干细胞治疗的临床评估


  详见下述。

 

四、分析与展望


  糖尿病下肢缺血,如糖尿病足等疾病。临床表现主要为早期的间歇性跛行,中期的静息痛和晚期的组织缺损,后者包括溃疡和坏疽。一般来讲,通过下肢动脉旁路移植或下肢动脉介入治疗可以达到增加行走的距离,缓解疼痛,或者促进溃疡的愈合等的目的。然而,对于部分患者,由于下肢远端动脉流出道不良,动脉旁路移植和介入治疗无法完成,或者效果不良,就面临着截肢的危险,甚至危及生命。尤其是糖尿病下肢慢性缺血患者,病变多累及下肢远端小动脉,在过去这部分患者就难以避免截肢。而干细胞移植、基因药物等作为血管再生的新技术,为此类患者提供了一种新的救肢方法。


  干细胞移植治疗下肢缺血的主要目标是促进下肢血管新生。血管新生有三种不同的形式:一种是血管生成(angiogenesis),在既存成熟血管床基础上芽式生长成毛细血管。另一种是血管形成(vasculogensis),指在原来没有血管系统的情况下内皮祖细胞(EPC)以非芽式生长,通过血管壁向内凹陷,贯穿毛细血管支柱导致血管腔裂开而形成血管网,称为血管发生,其与胎儿期血管发生机制一致。对于下肢缺血性疾病,既存动脉内皮细胞粥样硬化,故目前治疗多采用血管形成(vasculogensis)。EPC是指能直接分化为血管内皮细胞的前体细胞,包括从血液血管母细胞(hemangioblast,可分化为造血干细胞和EPC到成熟内皮细胞之间的多个阶段的过渡细胞。故EPC是机体生成新生血管的基础。


  EPC注入微循环后,邻近的体细胞决定其是保持静止状态还是自我复制或定向分化,微环境中的一些因子可维持EPC未分化状态并能把诱导其发生分化的因子排斥在外,但微循环的容纳能力有限,一旦EPC数量超过这个微循环的容纳能力,便会从微循环中分离出来并发生分化。Asahara等发现EPC大量存在于正常的骨髓、脐血、外周血和脾中,支持了成人体内存在循环EPC的假说。国外研究报道已从骨髓造血干细胞、外周血AC+133细胞、CD+34PFLK21+细胞分离出EPC,可在体内外分化为成熟的血管内皮细胞并形成血管。高增殖潜能和定向归巢特性使EPC成为缺血性疾病基因治疗理想的靶细胞。局部注人后,EPC能定向移动到血管生成部位并整合到血管壁中,由其携带并释放出的蛋白质很容易通过血流扩散到全身从而更有效地促进血管发生。Kalka等将人的EPC移植给无胸腺裸鼠的缺血下肢后,缺血下肢的毛细血管密度和血流恢复明显增加,肢体丢失较对照组明显减少。郭连瑞等进行了类似的研究,不仅证实了其有效性,而且还发现在裸鼠体内无论采用缺血局部的肌肉内注射移植,或是采用动脉腔内注射移植,其效果基本一致,但是与对照组在统计学上均有明显差异。


  干细胞移植主要包括胚胎干细胞、脐带血和成体干细胞,由于胚胎干细胞存在伦理问题,目前主要处于研究,临床应用可能要在几年或十几年以后。目前临床上主要使用自体干细胞移植和胚胎干细胞移植。自体干细胞移植有2个优点:①不存在异体干细胞的免疫排斥;②没有胚胎干细胞的伦理道德问题。此外,还具有取材方便的特点。因此,目前自体干细胞移植治疗疾病应用较广泛。


  脐血干细胞免疫原性小、淋巴系统细胞含量少且不成熟,社会伦理限制较小,目前研究上多采用异体脐血干细胞,一般来源于足月产胎儿,产妇一般情况良好,排除合并糖尿病、高血压、冠心病等慢性病及肝炎、梅毒等传染性疾病,经产妇理解同意并签署知情同意书后于分娩过程中获取。随着中国逐步完成脐血库的建立,未来在治疗缺血性疾病时应用自体脐血分离得到的内皮前体细胞就不存在免疫排斥反应相关问题。


  根据自体干细胞的来源不同,自体干细胞移植一般分为骨髓的干细胞和外周血的干细胞移植和改良的骨髓干细胞移植。


  (一)干细胞移植的分类


  1、自体骨髓干细胞移植


  目前研究认为,骨髓单个核细胞中的CD34阳性细胞是EPC的主要来源,CD34(CD34为造血干细胞及内皮细胞表面标记物)细胞,在末梢血中只有骨髓的0.2%。可测定的最幼稚细胞在1m1末梢血中仅有2.9个,为骨髓的1%。这就提示,骨髓细胞有可能提供更多的EPC用于血管新生疗法。骨髓单个核细胞(BM—MNC)移植是由EPC移植衍生出来的一种血管新生疗法。成年个体的BM-MNC中含有多种干细胞成分,其中EPC含量约占BM—MNC总数的3%,为外周血的15倍,同时BM-MNC移植还可以提供多种促血管生长因子,故BM—MNC移植兼具EPC和细胞生长因子的作用。应用自体骨髓细胞移植的优点可归纳为:①包括EPC,能够参与缺血病变中的血管形成;②能产生诱发血管生成的一些生长因子和细胞因子;③不会发生异体骨髓移植的移植物宿主疾病;④分离EPC花费高昂,耗时费力,且分离EPC的同时也去除了可能促进血管生成的细胞和细胞因子。故目前治疗下肢缺血时多采用含有EPC的单个核细胞进行移植。Shintani等将兔的自体骨髓单个核细胞注人缺血下肢的腓肠肌,2周后发现移植的骨髓单个核细胞存在于骨骼肌的新生内皮细胞毛细血管网,毛细血管密度较对照组增加,提示自体骨髓单个核细胞局部移植增加缺血下肢的新生血管形成和侧支血管形,取得了较好的临床疗效。


  Tateishi等首次报道应用自体骨髓干细胞移植治疗下肢缺血性疾病,开创了血管新生在临床应用的先例;谷涌泉等首先在国内应用自体骨髓干细胞移植治疗糖尿病下肢缺血性疾病并取得了成功。目前已经治疗了1000余例患者,取得了令人兴奋的疗效。谷涌泉等不仅采用了国外的方法,即下肢肌肉局部注射;而且还在国际上率先采用了经下肢动脉导管注射的新方法,并对这2种不同自体骨髓干细胞移植的方法治疗严重下肢缺血性疾病进行了对比。发现这2种方法的疗效在统计学上没有明显差异。


  在宣武医院的经验中,发现大多数患者达到了避免截肢或降低截肢平面的目的。为了证实这种治疗作用是否是干细胞的作用或是其他因素的影。向,我们也进行了相应的临床研究,选择了22例同时有双下肢缺血的患者作为对象,随机分成2组,采用2种不同浓度干细胞同时进行双下肢对照性移植,发现浓度(细胞总数)低于105 的移植几乎没有效果或仅有轻微的主观方面的好转。而大于108的移植可以得到一定的临床疗效。说明了自体骨髓干细胞移植效果是可以肯定,而且疗效与浓度有关。


  2、自体外周血干细胞移植


  正常生理状况下,“定居”骨髓的绝大多数骨髓干细胞(99.15%)处于休眠状态(G0期),仅0.65%的骨髓干细胞在血液中“游行”和“巡逻”。当某些组织中的细胞因衰老等原因死亡时,此部位会产生一“位置缺陷”信号,此信号的产生不仅来自细胞死亡后留下的位置空缺,及细胞破裂后释放的胞内细胞因子及蛋白分子,也可产生此部位局部浓度梯度的改变。这些因变化而产生的信号将使骨髓干细胞被“征募”到循环中参与远处多种组织的再生。但这种“自发”的“征募”作用较弱,人们想到用骨髓干细胞动员剂将骨髓干细胞“驱赶”到外周血中,从而使外周血干细胞达到治疗数量,利用干细胞“自发”的向损伤组织“归巢”,并在特定的组织微环境作用下分化为受损组织细胞的特性,达到修复缺血损伤的作用。利用骨髓和外周血干细胞池之间的动态平衡,动员骨髓干细胞促进其进入外周血以供采集、移植,从而使自体外周血干细胞移植成为一种治疗缺血性疾病有效的途径之一。


  中国医学科学院天津血液病研究所黄平平等在采用外周血干细胞治疗白血病的基础上,采用类似的技术手段,在国际上最早开展了自体外周血干细胞移植治疗下肢缺血并取得了成功。他们研究的临床效果很令人鼓舞。我们和沈阳空军第463医院也相继开展此技术。我们于2003年12月开始,到目前为止已经治疗100余例患者,大多数患者的临床症状明显改善。因此我们认为:自体外周血单个核细胞移植治疗下肢缺血性疾病也是一种简单、安全、有效的方法;然而由于骨髓动员期间,外周血液循环中单个核细胞的量增加明显,外周血的黏稠度明显增加,血管内血栓形成的机会大大增加,从而增加心肌梗死或/脑梗死发生的危险。我们在临床研究中就出现了1例心肌梗死和2例脑梗死,因此,我们在骨髓动员早期就采用了正规的抗凝措施,这些并发症表现比较轻微,没有引起严重后果。因此,我们认为在整个过程中需要注意心脑血管并发症的发生。后来我也改良这种技术,即骨髓动员不超过3天,外周血液循环中单个核细胞浓度不高,一般不会引起严重后果。


  3、改良的骨髓干细胞移植


  在单纯骨髓干细胞移植中,骨髓血的抽取量一般在400~500ml,得到的骨髓单个核细胞总数在(1~3)X109个。由于我们的患者,属于糖尿病后期,大多年龄比较大,体弱并多伴有其他疾病,如冠状动脉硬化性心脏病或/和脑动脉硬化症等,如果一次抽取过多的骨髓血,势必造成其他并发症。在我们的过去研究中发现:在同等条件下,疗效与细胞总数正相关,即量越大,效果应当越好。如何在减少每次骨髓血抽取的总量,同时又能增加或至少不降低疗效?这对于我们来讲是一个挑战。经过我们的努力,已经找到了一种新的方法,就是骨髓动员刺激以后的骨髓干细胞移植,我们也称之为“改良的骨髓干细胞移植”。主要步骤是在抽取骨髓前使用粒细胞集落刺激因子(GSF)刺激骨髓2~3天,每天300μg;然后抽取骨髓血110~200ml,在干细胞实验室分离纯化后再进行移植。从我们的资料中发现:无论是主观评价指标,或是客观评价指标均比我们以前研究结果的疗效明显提高;而且不良反应也较外周血干细胞为少。取得了令人兴奋的结果。而且我们后来的随机对照研究的结果也证实了这种改良的骨髓干细胞移植效果明显优于非动员的骨髓干细胞移植。因此我们认为:经过骨髓动员刺激后的骨髓单个核细胞移植下肢缺血,具有抽取骨髓血少,细胞量多,近期效果好,且安全性高的优点,是除自体骨髓单个核细胞移植和外周血干细胞移植以外的又一种治疗下肢缺血的新方法。而且随访结果也显示这是一种值得推广的方法。


  经过多年的临床上的实践,目前我们已经积累了一些宝贵的临床经验,而且我们也得到了中期的随访结果;然而整个中期结果显示并不十分理想。我们随访了2003年3月到2005年12月在我院接受治疗的70例患者的情况,其中65例属于骨髓干细胞移植,5例属于外周血干细胞移植。平均随访时间为21.5个月。病变情况如下:①单纯动脉硬化闭塞症(ASO):4例(5.7%);②血栓闭塞性脉管炎(TAO):6例(8.6%);③糖尿病下肢缺血(DMF):60例(85.7%)。本组患者在随访期间共8例死亡,均死于与干细胞移植无关的疾病,其中5例死于心肌梗死和心衰,3例死于脑梗死。死亡时间:有2例死于6个月以内,属于无效;其余均根据评价标准划归为有效或显效。而截肢中有1例为术后11个月,为有效。复发7例中,有3例于术后半年以后复发,另外4例保持在1年以后才复发。本组总有效率68.6%(48/70),总的无效率为21.4%(15/70),复发率为10%(7/70)。具体分析每年的疗效发现:疗效保持大于6个月以上的有效率为78.6%(55/70),疗效保持1年以上的有效率为65.7%(46/70),疗效保持2年以上的有效率为37.1%(26/70),疗效保持37个月以上的有效率为18.6%(13/70)。


  尽管如此,我们仔细分析结果发现一个非常可喜的现象,即本组有12例患者在5年时间内接受干细胞移植在2次或者2次以上,最后随访时全部保持有效,有效率高达100%。为什么会如此?我们进一步分析后认为:这既是成体干细胞的缺点,同时又是他的优点。我们知道胚胎干细胞最大的缺点是在体内可能出现不可控的生长,目前人们尚没有很好的手段控制,因此胚胎干细胞的致瘤性目前尚无法得到解决。而成体干细胞在体内增殖分化到数代后,可能会停止生长。临床效果就取决于患者病变发展的速度与血管新生的速度,如果血管新生速度快于病变发展速度,效果就明显,反之亦然。当成体干细胞在体内停止生长时,而病变还在进一步发展,到了一定程度,病变就会复发,甚至加重。而多次移植后有不断地补充血管新生的种子,病变就会得到改善。成体干细胞这种有限的分化恰恰避免了胚胎干细胞的致瘤性的缺点,从而达到了既有效又安全的目的。这也是我们追求的目标。


  4、脐血干细胞移植


  脐血干细胞移植(Cord Blood Stem Cell Transplantation, CBSCT)是一种异体造血干细胞移植技术。1988年,法国人Gluckman应用脐血成功治疗了1例罹患Fanconi贫血的5岁幼童,从此拉开了脐血干细胞移植在各个疾病治疗领域发挥作用的序幕。目前脐血移植治疗的疾病已经达到80余种,治疗的患者全世界已经超过了6000例。脐血移植已经在恶性肿瘤、免疫缺陷、心脏病、神经系统损伤、组织器官修复、糖尿病等治疗上显示出了巨大的潜力。从目前其他学科的临床治疗应用中初步可以看到,脐血具有诸多优势,如来源丰富,抗原表达弱,加之间充质干细胞的免疫调节及加速造血恢复等影响,脐血的移植成功率高,移植反应弱、移植物抗宿主病少见。


  近年来,随着再生医学的发展,干细胞移植为这类患者带来了治疗希望。传统的干细胞治疗手段包括骨髓血干细胞、外周血干细胞,虽然二者目前已经证实可以作为治疗糖尿病下肢缺血性疾病的有效手段, 但自身还是存在一定的局限。移植之前骨髓动员存在一定风险, 尤其是考虑目标人群高龄和易合并多种心脑血管疾病、高血压、高血脂的特点,骨髓动员时引起的外周血白细胞升高、血液粘稠度增加及血液流变学改变, 会增加心梗和脑梗的发病率,骨髓动员过程中发生意外的可能性要明显高于正常人群, 采用脐血干细胞移植就能够避免这些风险。脐血干细胞移植较骨髓或外周血干细胞移植有其独特的优势: ①脐血干细胞来源广泛,取材方便,不会造成痛苦; ②富含多种分化潜能的细胞、造血前体细胞及细胞因子,对缺血局部作用更强; ③脐血干细胞抗原性低,发生免疫排斥反应机会少; ④脐血有胎盘的过滤保护,发生感染的机会更少。⑤骨髓干细胞自体移植,往往需要采集患者骨髓血的量比较大,一般需200 ml,该失血量对于高龄患者而言本身就存在生命危险。⑥合并下肢血管病变等慢性并发症患者多为年龄较大的中老年患者,由于其自体干细胞数量及分化能力的下降,常伴有外周血内皮祖细胞数量减少,且增殖、迁移潜力、黏附和成血管能力均减弱;与使用其外周血干细胞或骨髓干细胞移植治疗相比,脐血富含内皮祖细胞、造血干细胞及间充质干细胞。⑦骨髓干细胞中内皮祖细胞的功能较正常明显下降,将影响移植的效果。因此,如果脐血干细胞移植和骨髓及外周血干细胞移植同样有效,那么脐血干细胞移植来源更广泛,移植方法更简单,将成为治疗糖尿病下肢慢性缺血的新选择。

 

  (二) 临床应用注意事项


  1、技术的准入
  自体于细胞移植和脐血干细胞移植均需要医院的医学伦理委员会和新技术委员会的批准。


  2、患者的选择(适应证与禁忌证)


  (1)适应证
  1)各种原因导致的慢性下肢缺血性疾病影像学检查病变血管无流出道,同时无法行手术搭桥或者介入治疗,而保守治疗无效者;
  2)尽管有较好流出道动脉,有动脉旁路移植或者介入成功可能,但是对于年老体弱,无法耐受手术创伤打击的患者;


  (2)禁忌证  并不是所有的糖尿病下肢缺血的患者都适合进行干细胞移植。下几种情况属于排除的对象:


   1)控制不好的糖尿病患者;目前我们在临床上有以
  2)过去5年内明确有恶性疾病的患者或血中肿瘤标记物(AFP,CEA,PSA,CAl9-9,CA125)水平明显升高者;
  3)严重心、肝、肾、肺功能衰竭或一般状况很差不能耐受干细胞移植手术者;
  4)近期有心肌梗死或脑梗死病史者禁忌,而有冠心病、脑缺血病史者也要慎用;
  5)目前仍在吸烟又不准备戒烟者;
  6)主髂等大动脉闭塞者。


  3、患者的准备


  (1)思想准备  不少患者经常在术前紧张,不清楚干细胞是何种新技术?这时我们一定要比较详细地向患者说明干细胞的优点和不足之处,使患者有比较充分的准备。特别要说明干细胞的微创性,使患者消除顾虑,轻装上阵。


  (2)身体准备  在移植部位要备皮等处理,需要血管腔内介入方法的患者,术前可以先行碘过敏试验,合理抗生素选用,并行过敏试验等。


  (3)手术当天要禁食水,静脉输液保证患者的基本的需求量和营养。备血200ml,在穿刺骨髓,抽取骨髓血之前缓慢输血。


  4、实验室的处理(干细胞制备)


  详见前述相关内容。


  5、干细胞移植的方法,步骤和措施


  一般有两种方法可以移植,分别为:缺血肢体的局部注射移植和下肢动脉腔内注射移植。医生可根据患者的身体情况和病变情况选择适合患者的方法进行移植。


  (1)局部缺血肌内注射


  1)麻醉可选用硬膜外或者腰麻,也可选择静脉复合麻醉。由于注射范围广,次数多,局部麻醉不推荐。麻醉成功后,可以消毒、铺巾。也可以先消毒、铺巾后再麻醉。
  2)抽取20~50ml的生理盐水稀释制备好的干细胞悬浊液,然后抽取上述稀释后的干细胞悬浊液备用。
  3)在注射部位划出要注射的具体位置。一般针距2cm。每针注射1ml。
  4)注射后用酒精纱布消毒皮肤后包扎。


  (2)下肢动脉腔内注射


  1)一般选用局部麻醉。先消毒、铺巾后,用1%利多卡因行股动脉区域的局部麻醉,成功后穿刺同侧股动脉或者对侧股动脉,放置5F动脉鞘管后备用。
  2)用导丝和导管缓慢选择到下肢动脉,交换导丝后,送人球囊到病变部位,充盈球囊,阻断动脉后将干细胞悬浊液缓慢推人动脉腔内。3~5分钟完成,放松球囊并撤除。
  3)退出动脉鞘管,压迫穿刺口15~20分钟后包扎穿刺口。


  6、干细胞移植术后的处理


  (1)术后处理一般要采用抗生素3天。
  (2)对于局部注射患者,术后2~3天后换药,撤除包扎的纱布,患者恢复到正常状态。
  (3)对于动脉腔内注射患者:一般术后患者要卧床24小时,下肢制动6小时。术后要用低分子肝素预防卧床造成的血栓形成。
  (4)对于糖尿病足患者术后要常规应用低分子肝素,这对于微血栓的治疗有一定作用。
  (5)术后也可以采用血管扩张药物。


  7、干细胞移植术后评价


  (1)安全性评价  干细胞移植的安全性问题不容回避。对干细胞移植安全性的忧虑主要是免疫排斥和肿瘤生长的问题。采用自体干细胞移植将不存在免疫排斥的问题;但由于干细胞是未分化细胞,移植的干细胞是否会在移植部位分化为其他组织如骨组织或出现肿瘤样生长?我们的患者中有一些患者移植后未能避免截肢,对30余例截肢标本的病理学检查,并未发现移植部位有成骨现象和肿瘤征象;500多例未观察到严重不良反应。而且我们的病例中有相当一部分随访时间超过了5年,可以说明本技术方法是安全的。因此,对于安全性的评价,必须注意下面几点:①是否有致瘤性?②有无局部的不良反应?包括局部有无红、肿、热、痛等炎症反应及过敏反应?③有无全身的不良反应?④术后肝肾等功能的变化?


  (2)有效性评价  临床观察有效性的主要指标和方法主要包括主观指标和客观指标。其中主观指标包括以下几点:疼痛、冷感、麻木等主观症状的改善程度。而尽管是主观指标,也要尽量地客观化。我们采用一个分数标准来评价这些主观指标。


   1)疼痛:疼痛评分标准:0分:无疼痛;1分:偶有疼痛,被问及能回忆起;2分:疼痛经常出现但能耐受,不需或偶用一般止痛剂;3分:经常用一般止痛剂;4分:因疼痛影响睡眠,一般止痛药剂难以缓解。治疗前:(  )分;治疗后:(  )分。


  2)冷感评分:0分:无冷感;1分:患者偶述受累肢体有发凉、怕冷的感觉;2分:受累肢体经常有发凉、怕冷的感觉;3分:受累肢体有明显的冷、凉感觉,需要采用局部保温措施,症状能得到一定程度的缓解;4分:受累肢体有明显的冷、凉感觉,采用局部保温措施,症状也无明显改善。治疗前:(  )分;治疗后:(  )分。


   3)麻木的评分标准:0分;无麻木;1分;偶感轻度麻木;2分;经常有轻度麻木不适;3分:麻木感觉明显,但可以忍受;4分:麻木非常明显,难以忍受,严重影响日常生活。治疗前:(  )分;治疗后:(  )分。客观评价标准主要包括①间歇跛行的距离:干细胞移植前后跛行距离的变化。主要测定无痛步行时间(分)或跛行距离(米),此项指标带有一定的主观性,但是如果使用平板实验,则是一种非常简单和客观的指标。②皮肤的温度差(双下肢):移植前后的变化。③经皮氧分压(TCPO:):作为全球通用的三大评估血管疾病金标准之一,直接反映血管向组织供氧情况,可以对肢体缺血情况的定量评估,可以评估组织存活率;是一种无创,低成本并可重复使用的检查方法;经皮氧分压测定,是一种比较客观的指标,国外经常用此项检查作为截肢与否和预测截肢平面,一般临床上以20mmHg作为临界值,不过受周围环境影响较大,因此检查前患者一定静息平卧30分钟以上,检查室内温度要保持恒温。④患肢发绀及溃疡的面积和深度(mm),坏疽范围测量并标记,作为客观的评价指标之一,能够证明干细胞移植后是否有效;不过,即使血供得到了改善,溃疡面的愈合仍需要一定的时间,尤其是较大溃疡者,一般近期疗效中仅适用于小溃疡者。⑤测定静息状态下踝肱指数(ABl);是一种简单、方便和有效的客观评价指标,但是不少患者在短期内不会增加得很明显。⑥激光多普勒血流量的测定:作为一种评价下肢血供的金标准之一,具有灵敏度高,操作简单的优点,是一种非常好的无创检查的评价指标。⑦动脉造影(DSA):观察侧支血管形成情况并评分。根据新生侧支血管评估分4级:0(无新生侧支血管)、+1(少许新生侧支血管)、+2(中量新生侧支血管)和+3(丰富新生侧支血管)。⑧截肢平面的变化:由于血管性截肢与血液供应具有相关性,截肢平面经常受到血液供应的影响。如果移植前后的截肢平面有一定的变化,能够达到降低截肢平面的目的,也能够说明干细胞移植的有效性。


  8、干细胞移植术后不良反应的处理


  尽管干细胞移植是一种比较安全的方法,我们仍要特别重视干细胞移植后不良反应的处理,以免造成些不必要的损失和麻烦。


  目前根据我们的经验,不良反应主要由以下几个方面:①局部不良反应:主要表现局部红、肿、热、痛等炎症反应。对于此类反应可以采用酒精纱布外敷,抬高患者肢体等措施,并试用抗生素等。②全身不良反应:主要有疲劳,全身乏力等,可以使患者卧床休息、静脉输液加速体内一些毒素的排泄。


  9、干细胞移植临床应用的启示——如何改进技术,提高疗效和安全性


  目前干细胞移植的疗效还没有达到十分完美的程度,如何改进技术和提高疗效是我们今后需要进一步研究的工作。我们目前采用改良的骨髓干细胞移植使疗效能够提高5%~10%,这也是我们今后更要加强研究的措施之一。此外我们认为:提高干细胞移植的疗效必须注意以下几点:


  (1)严格适应证的选择  如果适应证的选择不合适,就不可能有比较好的疗效。 
  (2)尽量采用骨髓动员的方式  骨髓动员后取骨髓干细胞优点:①动员时间短,外周血白细胞数不致太高;②采髓量降低,并发症少;③干细胞数量增加,疗效提高。
  (3)尽量选择膝下病变者  ①膝下病变效果明显高于大腿动脉闭塞者;②大腿动脉——股浅动脉病变的疗效优于股总动脉病变者。
  (4)实验室条件与管理——干细胞的制备  ①注意无菌观念;②每一步都要严格操作,尽量减少干细胞在制备过程中的丢失;③与血液科的白血病干细胞制备有一定区别,尽量选用大试管离心,也是达到减少干细胞的丢失。
  (5)注射部位要掌握好。


  总而言之,干细胞移植在治疗下肢缺血疾病既安全又有效,是一种具有非常广阔前景的方法,而且操作简单,费用低廉,值得我们推广。

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